Co-IP和GST pull-down都是用于检测蛋白相互作用的实验，两者有很多相似之处，但在原理及实验操作上也存在一定的区别。

本文就Co-IP和GST pull-down在原理及操作流程上的区别做详细的讲解，同时结合文献案例给大家分享CoIP和GST pull-down实验结果的分析方法。

Co-IP 基本原理

用某一蛋白的抗体，在细胞裂解液中与相应的蛋白（诱饵蛋白）结合，用Protein A/G将抗原抗体复合物拉下，最后在拉下的复合物中检测是否存在与诱饵蛋白相结合的目的蛋白。

GST pull-down 基本原理

利用重组技术将探针蛋白与GST融合，融合蛋白通过GST与固相化的载体上的GTH亲和结合。因此，当与融合蛋白有相互作用的蛋白通过层析柱时或与此固相复合物混合时就可被吸附而分离。

Co-IP和GST pull-down实验都是通过一种多组分的固相复合物将诱饵蛋白固定，随后富集靶标蛋白，从而确定靶标蛋白和诱饵蛋白互相作用的事实，整体思路是很类似的。不过由于固定诱饵蛋白的方法不同，二者在适用范围及实验难度上均有差异。

Co-IP：反映的是两个蛋白在体内或细胞水平的相互作用，因为在进行CoIP检测时，样本一般源于非变性裂解细胞，活细胞状态下蛋白质之间的相互作用被保持，所以其反映的是细胞中真实的蛋白互作情况，

在实验难度上，因为固相复合物组分多，需要非变性环境，并且对诱饵蛋白抗体的质量有较高要求，整个实验相对而言难度较大。

GST pull-down：一般用于体外实验，因为诱饵蛋白是需要加上GST标签的重组蛋白，所以是非生理状态下的验证，蛋白质的结构和形式可能与天然状态下存在一定差异，

在实验难度上，重组诱饵蛋白一般采用原核表达体系，有高效的商业化载体（真核表表达体系也可以做，但需要找到合适的载体）；并且固相复合物组分更少，有商业化的GSH琼脂糖珠，整个实验相对而言难度较低。

Co-IP

阴性对照：排除非特异结合的情况

只加入beads不加入IP抗体；

加入同型IgG作为IP抗体对照（常用）；

加入标签空载组/空白对照组（常用）；

使用不表达靶蛋白但表达另一相互作用蛋白的样品做对照。

阳性对照（Input对照）

细胞或组织样本裂解物，预留样本，含有靶蛋白和预测相互作用蛋白。

input通常用于评估实验样品的质量，确定样本中目的蛋白的存在，以及为后续Western blot或质谱分析提供对比。通过比较input中的总蛋白质与免疫共沉淀后的蛋白质，可以确定免疫沉淀的效率和特异性。

IP实验组

富集靶蛋白，对预测相互作用靶蛋白进行检测。

GST pull-down

Input

证明样品中加入了对应的蛋白，以及加入的蛋白量。

实验组中加入的是GST融合蛋白，对照组是GST蛋白，实验组和对照组都加入His融合蛋白，目的是证明GST标签不会和His融合蛋白有相互作用。 

Pull down

通过GSH Beads 沉淀GST蛋白或GST融合蛋白，如果GST融合蛋白能够拉下His融合蛋白，而GST不能拉下His融合蛋白，则说明A蛋白和B蛋白有相互作用

都拉下来或者都拉不下来则不能说明A蛋白和B蛋白有相互作用。

在清楚知道操作流程的前提下，弄清楚图中各个部分所代表的实验步骤，结合图中展示的结果进行分析，便可以看懂实验结果图。

文献案例1：Co-IP&GST pull down结果分析

Input：全细胞裂解液，诱饵蛋白与靶蛋白表达的检测确认。含有细胞内所有的蛋白，可认为是阳性对照。也就是处理完样本得到的细胞裂解液，在做IP实验之前，需要先跑WB，确认样本中含有蛋白A和蛋白B。

IP：全称immunoprecipitation，即免疫沉淀，这一步主要是为了纯化富集目的蛋白。

IB：全称immunoblotting，即免疫印迹，也就是常规的Western Blotting，用于显示目的蛋白。

IgG：阴性对照。Anti-A的同型对照抗体，即跟Anti-A同来源同种型，如Anti-A是兔来源IgG型，则同型对照抗体需要选择Rabbit IgG。

Anti-A：A蛋白的免疫共沉淀抗体。

结果解读

由Input组的条带可以得到结论，蛋白A与蛋白B都是存在的，证明样本处理提取蛋白的步骤没有任何问题；

阴性对照IgG组和实验组平行进行免疫沉淀实验，结果蛋白A与蛋白B均没有条带，说明利用IgG抗体没有把蛋白A和B沉淀下来，证明蛋白A和B与IgG没有结合，排除了蛋白与抗体非特异性结合的可能性；

而实验组蛋白A和B均有条带，表示利用蛋白A的抗体进行沉淀实验，成功把蛋白A沉淀下来了，与此同时蛋白B也被沉淀下来，进而得到结论：蛋白A与蛋白B之间存在相互作用。

该研究将Myc-NICD表达载体导入293T细胞，然后进行Co-IP分析，以确定Myc-NICD与内源性AIB1之间的相互作用。

A上图中，Myc-NICD是诱饵蛋白，靶蛋白是AIB1。抗体是针对AIB1的IgG。

①用Myc-NICD蛋白的IP级抗体拉蛋白Myc-NICD，因为存在互作，还有其它蛋白会被拉下来。在WB检测时，Input蛋白和下拉蛋白中都能用Myc-NICD的抗体检测到Myc-NICD；

②验证Myc-NICD和AIB1是否有相互作用。首先在Input蛋白中可以用AIB1的抗体检测到AIB1；其次，在Myc-NICD抗体下拉的蛋白物中也可以用AIB1的抗体检测到AIB1。结果满足上述两个条件，则说明Myc-NICD和AIB1之间存在相互作用。

③结果表明，AIB1抗体能沉淀内源性AIB1和Myc-NICD，而不是对照抗体(图A，上图)。同理，AIB1和Myc-NICD可以被Myc抗体下调(图A，下图)。这些结果表明，AIB1可以与NICD在细胞内相互作用。此外，通过使用抗AIB1和抗NICD抗体的Co-IP分析，也可以在CT26细胞中检测到内源性AIB1和NICD的相互作用(图B)。

为了确定AIB1是否可以直接与NICD结合，将大肠杆菌产生的GST-NICD蛋白与基于大肠杆菌提取物的无细胞蛋白质合成系统产生的AIB1蛋白孵育，进行GST pull down检测是否直接互作。

结果表明，GST-NICD蛋白，而不是GST，能够下调AIB1(图C)，表明AIB1可以直接与NICD结合。为了确定AIB1的哪些结构域可以与NICD结合，在293T细胞中表达了不同的AIB1结构域蛋白，并进行了GST pull down实验。结果表明，AIB1的HAT结构域负责AIB1与NICD的相互作用(图D，下图)。

为了确定AIB1是否能与MAML1相互作用，将Flag-MAML1表达载体导入293T细胞，并进行了Co-IP实验。结果表明，AIB1抗体可沉淀内源性AIB1和FlagMAML1(图E，上图)。反过来，AIB1和Flag-MAML1可以被Flag抗体拉低(图E，下图)。这些结果表明，AIB1在细胞内可以与MAML1相互作用。

为了确定 AIB1 是否可以直接与 MAML1 结合，将大肠杆菌产生的 GST-MAML1 蛋白与基于大肠杆菌提取物的无细胞蛋白质合成系统产生的 AIB1 蛋白一起孵育，进行 GST  pull down下拉试验。结果表明，GST-MAML1 蛋白能够下拉 AIB1，但 GST 不能（图 F），这表明 AIB1 可以直接与 MAML1 结合。

结果解读

该图为验证蛋白EDR1与蛋白EDR4之间是否存在相互作用的结果图。

由图中可以得到：蛋白EDR4带有GDP标签，蛋白EDR1带有FLAG标签，该实验为利用蛋白标签来沉淀和检测蛋白。

该Co-IP实验实验被分为两组，第一组存在GFP标签及EDR1-FLAG蛋白，第二组存在EDR4-GFP蛋白及EDR1-FLAG蛋白；图中共有三组胶图，分别是Input组，IP组，以及Co-IP组。

观察图片的顺序为Co-IP实验操作顺序相同。

首先观察Input组，即阳性独照组。第一块胶图为利用anti-FLAG沉淀FLAG标签，发现两个条带都在130kd处有蛋白，说明两组实验都存在EDR1-FLAG蛋白且其大小为130kd，第二块胶图为利用anti-GFP标签沉淀GFP标签，发现第一条带在25kd存在蛋白而第二条带在130kd存在蛋白，说明第一组实验存在GFP标签，且大小为25kd，第二组实验存在EDR4-GFP蛋白且大小为130kd。

随后观察IP组，该组图表示的是利用anti-FLAG对EDR1-FLAG蛋白进行沉淀，图上显示两组实验在130kd都存在蛋白，说明两组实验的EDR1-FLAG被沉淀下来。

最后观察Co-IP实验组，该组图表示在IP组的基础上进一步利用anti-GFP检测GFP标签，图上显示第一组实验没有条带，而第二组实验在130kd处有蛋白。说明IP组没有把GFP标签共沉淀下来，但是把EDR4-GFP蛋白共沉淀下来了。说明EDR1-FLAG蛋白不能与GFP标签相互作用，但是可以与EDR4-GFP蛋白相互作用。

由此可得到结论：EDR1蛋白可以与EDR4蛋白存在相互作用。

结果解读

该图为验证蛋白ChREBP与蛋白HDAC1之间是否存在互作的结果图。

蛋白ChREBP带有FLAG标签，蛋白HDAC1带有Myc标签。该实验是利用标签抗体去沉淀及检测带有标签的蛋白。

该实验共有三组，第一组为加Myc-HDAC1不加FLAG-ChREBP，第二组为加FLAG-ChREBP不加Myc-HDAC1，第三组为两个都加。实验共有四张胶图，分别为IB：Myc、IB：FLAG（这两张胶图为阳性对照），IP：FLAG IB：FLAG（IP组），IP：FLAG IB：Myc（Co-IP组）

最下面两个胶图为利用IB验证Myc-HDAC1及FLAG-ChREBP存在的阳性对照。

第二张胶图表示的实验操作是利用anti-FLAG沉淀FLAG-ChREBP蛋白，图上显示经IB验证第二、第三组FLAG-ChREBP蛋白被成功沉淀下来，而第一组没有结果（第一组不存在FLAG-ChREBP蛋白）。

第一张胶图表示在anti-FLAG沉淀FLAG-ChREBP蛋白的基础进行IB检测验证Myc-HDAC1蛋白是否存在。图上显示第一、第二组实验没有检测到（第一组不存在FLAG-ChREBP蛋白，第二组不存在Myc-HDAC1蛋白），但是第三组实验检测到了Myc-HDAC1蛋白。

由此可以得到结论：两个蛋白都存在的时候，当FLAG-ChREBP蛋白被沉淀，Myc-HDAC1蛋白也会被共沉淀下来，ChREBP蛋白与HDAC1蛋白之间存在相互作用。

结果解读

该图为验证蛋白X与蛋白Y是是否存在相互作用的结果图。

由图可以发现，该实验被分为两组：input组及IP组，有两块胶图，第一块是IB验证蛋白X的存在，第二块是IB验证蛋白Y的存在。

由对照组的条带可以得到结论：蛋白X与蛋白Y都是存在的。IP组的第一个条带表示利用IgG进行沉淀实验，结果蛋白X与蛋白Y没有被沉淀下来，说明蛋白X、蛋白Y不能与IgG结合（阴性对照，用于排除蛋白与抗体非特异性结合的可能性）；IP组的第二条带表示利用蛋白X进行沉淀实验，结果蛋白X被沉淀下来，蛋白Y也被沉淀下来。

由此得到结论：蛋白X-蛋白Y之间存在相互作用。

结果解读

该图为验证CAT3蛋白与CPK8蛋白之间存在相互作用的结果图。

由图可以得到，两个蛋白分别加了标签，利用标签进行蛋白的沉淀及检测。

实验共分三组，第一组为存在GFP-CAT3，不存在cMyc-CPK8；第二组为存在cMyc-CPK8不存在GFP-CAT3，第三组为两个都存在。实验共有两组胶图，一组为阳性对照组（Input组），另外一组为实验组（Output组）。由Input组可以得到结论：三组实验中的组分都是正确的。分析Output组发现：anti-cMyc在第二、第三条泳带都有，而anti-GFP只有第三条带有蛋白，由此推测实验组的实验操作为利用anti-cMyc进行沉淀实验，在利用IB检测GFP-CAT3的存在。

从实验组第三条带可以发现当cMyc-CPK8蛋白被沉淀下来时GFP-CAT3蛋白也会被共沉淀下来，由此得到结论：cMyc-CPK8蛋白与GFP-CAT3蛋白存在相互作用。

结果解读

作者在GST的N端融合Sw-5b蛋白，在NSm21蛋白添加YFP标签便于免疫印迹。

GST pull down+YFP IB组：表示GST pull down实验后用YFP进行免疫印迹。发现GST + NSm21-YFP组和GST-Sw-5b + YFP组无条带，表明GST pull down体系中的GST与NSm21-YFP，GST-Sw-5b与YFP组分之间无互作，是阴性对照组。GST-Sw-5b + NSm21-YFP组有条带，表明两种物质之间存在互作，结合阴性对照组结果证明是Sw-5b 与NSm21之间存在互作。

GST pull down+GST IB组：表示GST pull down实验后用GST进行免疫印迹。发现三组均有条带，表明GST pull down实验体系可以正常发挥功能，也表明各组体系中含有GST相关的组分。

Input + YFP IB组：表示不经过GST pull down实验，直接对实验前各组的混合体系用YFP进行免疫印迹，是阳性对照组表明各组有YFP相关组分。

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